汉回蒙古族人MBLExonⅠ52位基因频率检测及其意义
赵铁军 韩 瑞 罗 强 贾天军 张庶民
甘露糖结合凝集素(mannanbindinglectin,MBL)是一种由肝脏合成和分泌的急性时相蛋白,可与甘露糖残基结合,参与细胞表面识别,是天然免疫(innateim munity)的重要组成部分,MBL基因多态性影响MBL水平,MBL的功能及基因结构和感染性疾病的关系近年来倍受关注.具有变异型MBL的个体,其血清MBL水平低下,导致调理功能缺陷[1～3]。本研究采用已建立MBLEXONⅠ52位密码子突变检测的方法[4]测定健康汉族人及蒙族,回族人MBL基因Exon152位密码子点突变的情况,为深入探索MBL基因突变引起调理吞噬缺损的机制和MBL分子的结构-功能关系及MBL在临床中的治疗应用奠定基础。
1 材料与方法
1.1 主要试剂 TaqDNA聚合酶(1U/μl,MBI),10×
Buffer(随酶增送),dNTP(Promega),琼脂糖(Sigma),红细胞裂解液,DNA提取液,TE缓冲液,Tris-乙酸(TAE)电泳缓冲液,PCRMarker(DL2000,大连宝生物公司)。
1.2 标本的收集 汉族人来自张家口市中心血站,经检验符合献血标准,蒙族标本来自内蒙古自治区集宁市中旗旗医院;回族标本来自张家口地区中小学。均为健康人群;收集静脉血标本用EDTA-Na2抗凝(抗凝比例为10∶1),分离血浆,-86℃保存,供测定MBL含量,细胞成分用盐酸胍法提取DNA。
1.3 染色体DNA的提取 取抗凝血的细胞成分200μl,用红细胞裂解液溶解红细胞,离心5000r/min5min/次,弃上清,2次后,用生理盐水平衡,离心12000r/min5min,去上清,采用胍盐酸法提取DNA,根据剩余体积依次加入不同体积的的提取液(包括7.5mol/L胍 盐酸、20mg/ml10%十二烷基磺酸钠等),70℃水浴10min,振荡混匀,再进行15min,离心收集上清,乙醇沉淀DNA,TE溶解,-20℃保存,供PCR用。
1.4 PCR-SSP检测方法的应用 用如下所述方法对所收集169例健康汉族人及58例蒙族人,100例回族人的Exon152位密码子碱基突变进行分析。
1.4.1 由大连宝生物公司合成引物 codon52D引物1为:5′-CTGCACCCAGATTGTAGGACAGAG-3′,引物2为5′-TCTCCCTTGGTGCCATCACA-3′;codon52nonD引物1为5′-CTGCACCCAGATTGTAGGACAGAG-3′,引物3为5′-TCTCCCTTGGTGCCATCACG-3′;ControlHGH- 1s5′-TGCCTTCCCAACCATTCCCTTA-3′,ControlHGH-′-CCACTCACGGATTTCTGTTGTGTTTC-3′。
1.4.2 扩增体系及参数设置如下 扩增体系为25μl, 其中10×buffer(含有[NH4]2SO4)2.5μl,dNTP(2.5 mmol/L)2μl,primer1(10pmol/L)2.5μl,primer2(10 pmol/L)2.5μl或primer3(10pmol/L)2.5μl,Control HGH-1s和ControlHGH-2as分别为(10pmol/L)2.5μl TaqDNA酶2μl(1u/μl),Mg2+1.6mmol/L1.6μl,模板2 μl灭菌三蒸水补足总体积。预变性96℃1min,变性 96℃25s,70℃45s,延伸72℃45s(循环5次),变性 96℃25s,65℃50s,延伸72℃45s(循环21次),变性96℃25s,55℃60s,延伸72℃2min(循环4次)。
1.5 扩增产物分析 扩增产物用TAE配制含0.5μg/ml溴化乙锭1.5%的琼脂糖凝胶电泳,电泳 4V/cm,30min;PCRMarker作为参照,对扩增产物进行分析,凝胶图像分析系统拍照,记录。
1.6 统计学方法 SPSS统计软件行χ2检验。
2 结果
检测169例健康汉族人52位密码子的点突变情况,野生型为161例,占95.3%;突变杂合型为8例,占4.7%。突变纯合子型(TGT/TGT)无。基因频率分别为CGT为0.976;TGT为0.024。检测58例蒙族人,野生型为58例,占100%。基因频率CGT为1,TGT为0。检测100例回族人,野生型为100例,占100%。基因频率CGT为1,TGT为0。组间比较,χ2=7.667,P=0.022< 0.05;汉族与蒙族人比较,χ2=2.846,P=0.092> 0.05,汉族与回族人比较,χ2=4.879,P=0.027< 0.05。见表1。
3 讨论
人类血清中MBL的水平主要由MBL编码基因结构决定,并受启动子区域基因的活性调节。已经发现在ExonⅠ有3个突变位点,编码区域上游突变会改变MBL的血清浓度,其中ExonⅠ的52位(Arg-Cys命名为等位基因D)、54位(Gly-Asp命名为等位基因B)和57位密码子(Gly-Glu,等位基因C)突变会干扰MBL多肽进一步组装成功能性多聚体,进而降低血清中功能性MBL的含量。而且研究发现其突变与许多疾病具有一定的相关性。在欧洲人群中,突变频率最高的是在密码子54位,Thomas等[5]报道在52位密码子突变和慢性乙肝感染(其他基因没突变)存在正相关(在欧洲人,而非亚洲人)。另一项日本研究学者的研究发现[6],52位密码子突变与丙肝患者的疾病进展呈正相关。本研究检测3个民族人MBLExon152位基因突变的情况,以期为进一步研究临床相关疾病发生时MBL的基因突变情况奠定基础。
用PCR-SSP方法就北方地区收集的汉族健康人及蒙族,回族人的MBL基因ExonⅠ52位密码子的点突变情况进行调查、分析,169例汉族人野生型为161例,占95.3%;突变杂合型为8例,占4.7%。突变纯合子型(TGT/TGT)无。基因频率分别为CGT为0.976;TGT为0.024。58例蒙族人,野生型为58例,占100%。基因频率CGT为1,TGT为0。100例回族人,野生型为100例,占100%。基因频率CGT为1,TGT为0。本实验研究显示,ExonⅠ52位密码子的点突变频率不高,组间比较差异有显著性;汉族与蒙族人差异没有显著性,汉族与回族人差异有显著性。但由于本研究受地域、检测例数所限,所得结果能否准确反应中国汉、蒙、回族人的MBL基因52位密码子点突变频率,还有待于扩大标本来源及检测例数,同时应联合检测其他位点的突变情况,作更进一步深入的研究。
参考文献
1 贾天军,李 萍,刘士先.MBL及其补体激活的LECTIN途径.国外医学生物化学与检验学分册,2001,22(6):316
2 KilpatrickDC.Mannan-bindinglectin:clinicalsignificanceandapplica tions.BiochimBiophysActa,2002,1572(2～3):401
3 BoldtABW,Petzl-ErlerML.Anewstrategyformannose-binding lectingenehaplotyping.HumanMutation,2002,19:296
4 赵铁军,贾天军,程建君.检测MBLEXONⅠ52位密码子点突变PCR-SSP方法的建立.国外医学临床生物化学与检验学分册,2004,25,5:3965 ThomasHC,FosterGR,SumiyaM,etal.Mutationofgeneformannose-bindingproteinassociatedwithchronichepatitisBvirusinfection.Lancet,1996,348:1417
6 SasakiK,TsutsumiA,WakamuyaN,etal.Mannose-bindinglectin polymorphismsinpatientswithhepatitisCvirusinfection.ScandJGas troenterol,2000,35:960
本文摘自《广州医学》2005.05，建议纳入回族研究。
